Navegando por Assunto "Enzimas proteolíticas"

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Análise de colinearidade gênica do operon aprX-lipA em isolados de Pseudomonas fluorescens
(2023-09-15) Silva, Israel Santos da; Freitas, Nara Suzy Aguiar de; Souza, Paulo Roberto Eleutério de; http://lattes.cnpq.br/1971832245117283; http://lattes.cnpq.br/6891650997818766; http://lattes.cnpq.br/9803828236017805
Pseudomonas fluorescens são bacilos gram-negativos que possuem motilidade e estão presentes em ecossistemas terrestres e aquáticos. Por possuírem característica psicrotrófica, essas bactérias estão frequentemente relacionadas à contaminação de leite não pasteurizado e seus derivados, como queijo e manteiga. As proteases e lipases produzidas por P. fluorescens são o principal fator na prevalência de contaminação de produtos lácteos. Essas enzimas são codificadas pelos genes aprX e lipA, presentes no operon aprX-lipA. Nesse sentido, avaliamos os componentes genômicos circunvizinhos ao operon aprX-lipA de P. fluorescens de diferentes origens, visando detectar padrões genéticos inerentes a esses organismos e sua correlação com a atividade proteolítica. Utilizamos o banco de dados do NCBI, a plataforma String e Interpro para avaliação comparativa dos genomas selecionados. Nos quatro isolados analisados o operon aprX-lipA é altamente variado, estruturalmente, com configurações exclusivas para cada genoma. As relações de co-expressão gênica dos genes circunvizinhos à protease aprX, também, apresentam variações qualitativas e quantitativas, intra e inter-espécies do gênero Pseudomonas. Detectamos os componentes do sistema CRISPR tipo 1, até então não relacionado com o operon, que podem amplificar, movimentar e modificar genes relacionados com o mecanismo de defesa, patogênico ou não, do gênero. Os padrões relacionados à patogenicidade indicam que novos biomarcadores podem ser utilizados pela vigilância genômica.
Estudo in silico de derivados naftoquinônicos potenciais inibidores da principal protease do SARS-CoV-2
(2020-11-05) Alencar, Natanael Ferreira de; Camara, Celso de Amorim; http://lattes.cnpq.br/4500025814149366; http://lattes.cnpq.br/7715134143959483
A COVID-19 é uma doença infecciosa que afeta principalmente os pulmões, foi identificada primeiramente na China e rapidamente se espalhou ao redor do globo se configurando numa grande pandemia. O agente causador da doença é um novo vírus da família coronaviridae, identificado como SARS-CoV-2. Diversos pesquisadores têm investigado modos de combater o vírus, fazendo uso da pesquisa in vitro, in vivo e in silico. Dentre as técnicas in silico a modelagem molecular é um forte aliado para a descoberta de novos fármacos e para a investigação dos modos como as moléculas interagem com os receptores biológicos, a principal e mais difundida dessas técnicas é o docking molecular e os métodos de otimização molecular por mecânica quântica. As naftoquinonas são um grupo químico encontrado em diversos grupos vegetais, dentre elas o lapachol, [alfa]-lapachona e [beta]-lapachona tem ganhado atenção por suas propriedades anticâncer, antiinflamatórias, bactericidas e até antiviral. Este trabalho tem como objetivo utilizar a modelagem molecular com 11 isômeros derivados da [alfa]-lapachona, [beta]-lapachona e o lapachol para verificar a eficácia inibitória frente à principal protease do SARS-CoV-2. Os métodos computacionais foram a modelagem das 11 moléculas por método semiempírico PM7 e a realização do docking molecular com a estrutura cristalográfica da enzima depositada no banco de dados PDB sob o código 6W79. Os resultados mostraram que os isômeros derivados da [alfa]-lapachona apresentaram menores energias de formação e total, melhores energias de afinidade frente a enzima. Os melhores ligantes foram os compostos que apresentam o grupo nitro e ácido sulfônico em suas estruturas, sendo o 1d, 2d, 1e e 2e obtiveram melhores energias de interação com a principal protease do SARS-CoV-2. 1d obteve -7,9 kcal.mol -1, o 2d obteve -7,8 kcal.mol -1, 1e obteve -8,1 kcal.mol -1 e o 2e obteve -8,5 kcal.mol -1 . Os resultados obtidos foram mais promissores do que resultados obtidos a partir da literatura com os principais medicamentos usados no tratamento da COVID-19 como a hidroxicloroquina e a azitromicina. Com isso, concluímos que as naftoquinonas são potenciais inibidores da principal protease do vírus SARS-CoV-2, desta forma este trabalho abre caminho para posteriores testes biológicos destas moléculas.
Investigação do extrato de cladódios de Cereus jamacaru quanto à composição química, potencial antimicrobiano contra Staphylococcus aureus e efeito larvicida para Aedes aegypti
(2023-09-21) Guimarães, Júlia Maria Rodrigues; Pontual, Emmanuel Viana; Alves, João Victor de Oliveira; http://lattes.cnpq.br/0882174483226946; http://lattes.cnpq.br/1777060469196142; http://lattes.cnpq.br/3701748857935689
Cereus jamacaru (Cactaceae) é uma planta do semiárido brasileiro que possui importância econômica e uso na medicina popular. O uso dos antibióticos atualmente comercializados acarreta em muitos efeitos indesejados e tem levado ao surgimento de bactérias resistentes, enquanto os inseticidas sintéticos possuem, geralmente, alta persistência no ambiente e forte toxicidade não alvo. Nesse sentido, a busca por novos agentes antimicrobianos e inseticidas tem crescido. O objetivo deste trabalho foi investigar o extrato de cladódios de C. jamacaru quanto à composição química (presença de lectinas, inibidor de proteases e metabólitos secundários), potencial antimicrobiano contra bactérias patogênicas e efeito larvicida para Aedes aegypti. Cladódios de C. jamacaru foram coletados em Recife, Pernambuco. Os espinhos foram removidos e os cladódios foram cortados em fatias e secos ao ar. Em seguida, foram triturados e o pó (10 g) foi homogeneizado (28°C, 16 h) com solução de NaCl 0,15 M (100 mL) em água, utilizando agitador magnético. A mistura foi filtrada e centrifugada (3.000 g, 15 min) e o sobrenadante correspondeu ao extrato de cladódios (CjCE) que foi investigado quanto à presença de lectinas utilizando eritrócitos de coelho, inibidor de protease utilizando tripsina bovina (0,1 mg/mL) e o substrato cromogênico e peptidomimético BApNA (8 mM), e metabólitos secundários por cromatografia em camada delgada. O conteúdo de compostos fenólicos em CjCE foi determinado utilizando o reagente de Folin-Ciocalteu (10%, v/v) e uma curva padrão de ácido gálico, enquanto flavonoides foram quantificados utilizando o reagente cloreto de alumínio (20%, m/v) e quercetina como padrão. Em seguida, o extrato foi investigado quanto à atividade antioxidante pelos métodos do DPPH, ABTS e Fosfomolibdênio. O potencial antibacteriano de CjCE foi determinado utilizando cepas de bactérias sensíveis ou resistentes a antibióticos pelo método de microdiluição em placa. A concentração mínima inibitória (CMI, menor concentração de CjCE capaz de inibir em 50% o crescimento bacteriano) foi determinada. Ensaio de hemólise por S. aureus foi realizado utilizando eritrócitos humanos e o efeito de CjCE (128, 64 e 32 µg/mL) sobre a hemólise foi investigado. O potencial larvicida de CjCE (0,40 a 3,5%, m/v) foi avaliado por tratamento (48 h) de larvas de A. aegypti no terceiro instar (L3). CjCE causou a aglutinação dos eritrócitos de coelho (8 UAH), sugerindo a presença de lectinas. O extrato reduziu a hidrólise do substrato BApNA por tripsina, indicando a presença de inibidor de proteases. A cromatografia em camada delgada de CjCE revelou a presença de açúcares redutores e análise quali-quantitativa mostrou 40,20±0,97 mgEAG/g de fenóis totais, dentre os quais, 3,36±0,07 mgEAG/g (8,36%) foram flavonoides. CjCE apresentou relevante atividade oxidante, com capacidade de sequestro dos radicais ABTS e DPPH (IC50 de 3.735 µg/mL e 2704, 50µg/mL, respectivamente), mas não foi hábil em causar redução do fosfomolibdênio. CjCE foi tóxico apenas para cepa de Staphylococcus aureus (UFPEDA 02) revelando um forte efeito bacteriostático (CMI de 199,09±0,85 µg/mL), e reduziu em mais de 90% a lise de eritrócitos causada pela bactéria, em relação ao controle. O tratamento de L3 de Ae. aegypti com CjCE acarretou em mortalidade de forma dose dependente (CL50 = 0,68 %, m/v). Por outro lado, quando as larvas foram tratadas com CjCE em concentração 10 vezes superior à CL50, houve eliminação do conteúdo intestinal coberto pela membrana peritrófica na tentativa de eliminar os componentes tóxicos do extrato. Em conclusão, o extrato de cladódios de C. jamacaru é um novo agente antimicrobiano capaz de inibir fortemente o crescimento de S. aureus e reduzir a toxicidade bacteriana para eritrócitos humanos. Ademais, a toxicidade para larvas de A. aegypti mostrada aqui aponta o extrato de cladódios de C. jamacaru como interessante material de partida para obtenção de formulações larvicidas. Os efeitos antibacteriano e inseticida do extrato podem estar ligados à presença de lectinas, inibidor de proteases e compostos fenólicos.
Produção de proteases por Aspergillus ochraceus URM 604 obtidas por fermentação em estado sólido utilizando farelo de trigo e resíduo de café como substrato
(2021-03-03) Santos, Amanda Lucena dos; Porto, Ana Lúcia Figueiredo; Cardoso, Kethylen Barbara Barbosa; http://lattes.cnpq.br/4784303425329040; http://lattes.cnpq.br/4989617783837981; http://lattes.cnpq.br/3697084385877618
Proteases são enzimas de grande interesse comercial, tendo aplicações em diferentes segmentos industriais, como o farmacêutico, de alimentos, bebidas e produtos de limpeza. Dentre os organismos capazes de produzir essas enzimas estão os fungos filamentosos, os quais apresentam como vantagens a possibilidade de secretarem enzimas de forma extracelular e de crescerem em substratos de baixo custo. A Fermentação em Estado Sólido (FES) é uma das técnicas preconizadas no cultivo desses organismos, especialmente por simular o habitat natural dos fungos, favorecendo o seu crescimento. Tendo em vista a importância das proteases e a crescente demanda do mercado global, faz-se necessário a busca por novas fontes e métodos de produção. Neste sentido, o objetivo desse trabalho foi produzir proteases sob FES pelo fungo Aspergillus ochraceus URM 604 utilizando substratos derivados da agroindústria. Foi estudado através de um planejamento fatorial 2³ a influência do tipo de substrato (resíduo de café, farelo de trigo e 1:1 café + farelo de trigo), quantidade de substrato (3g, 5g e 7g) e umidade (20, 40 e 60%) condições essenciais para a produção de proteases. A fermentação ocorreu por 7 dias a 30°C e o extrato metabólico foi utilizado para posteriores análises. Nas análises bioquímicas e físicas foram determinadas a atividade proteásica, proteínas totais, temperatura e pH ótimo das enzimas obtidas. Ao analisar a influência das variáveis adotadas no planejamento fatorial 2³ foi constatado que somente o tipo de substrato foi significativo. O melhor substrato foi o farelo de trigo que apresentou atividade enzimática específica de 218.27 U/mg sob as condições de 3g de substrato e 60% de umidade. As demais condições também apresentaram resultados elevados quando comparado a literatura. A temperatura ótima da enzima produzida foi de 50°C e o pH ótimo foi pH 8-9 (protease alcalina). Dessa forma, o presente trabalho demonstra que o fungo A. ochraceus URM 604 tem potencial biotecnológico para produção de protease sob FES utilizando substratos de baixo custo como resíduo de café e farelo de trigo, sendo este o primeiro relato para a espécie.
Produção e purificação de proteases de Aspergillus tamarii URM 4634 para aplicação no amaciamento de carnes
(2018-08-20) Almeida, Elizane Melo de; Porto, Tatiana Souza; Silva, Osmar Soares da; http://lattes.cnpq.br/4494348105027663; http://lattes.cnpq.br/8029060415742712; http://lattes.cnpq.br/6313442292667807
A biotecnologia enzimática está inserida em um dos cenários mais promissores quando se trata de produção, purificação e aplicação de moléculas de alto valor agregado, como as enzimas. As proteases pertencem a um grupo específico de enzimas que são capazes de catalisar reações hidrolíticas, o que resulta na clivagem de proteínas em moléculas de peso molecular menores como aminoácidos e peptídeos. Uma das fontes de obtenção de proteases é por meio dos micro-organismos em que nas etapas de produção envolvem os processos de upstream e downstream. A Fermentação em Estado sólido (FES) é uma operação intermediária desses processos, e pode ser conduzida com a utilização de fungos filamentosos como o Aspergillus tamarii. Através desses processos aliado a uma etapa de purificação podese obter as colagenases que são responsáveis pela hidrólise das ligações dos peptídeos do colágeno nativo e desnaturado. Dentre suas principais aplicações está o amaciamento de carnes. Diante do exposto, o presente estudo teve como objetivo a produção de proteases com atividade colagenolítica por FES, bem como sua purificação por cromatografia de troca iônica para posterior avaliação de seu potencial na tenderização de carnes. A protease obtida apresentou uma atividade colagenolítica de 296,6 U/mL e apresentou uma purificação de 6,28 vezes. O processo de tenderização apresentou forte eficiência da enzima ao degradar as proteínas miofibrilares observado pelo alto Índice de Fragmentação Miofibrilar (250,8) correspondendo a uma Fragmentação Relativa de 292,0%. Os resultados obtidos demonstram a grande potencialidade da colagenase obtida de Aspergillus tamarii em ser usada como amaciante cárneo.
Produção, extração, purificação e caracterização de proteases fibrinolíticas produzidas por Streptomyces parvulus DPUA 1573
(2021-11-29) Nascimento, Maria Clara do; Bezerra, Raquel Pedrosa; Batista, Juanize Matias da Silva; http://lattes.cnpq.br/6699725036732885; http://lattes.cnpq.br/1466206759539320; http://lattes.cnpq.br/5929405825655717
Devido ao seu potencial de degradação da fibrina, as proteases fibrinolíticas são uma alternativa promissora na indústria farmacêutica para o tratamento de doenças cardiovasculares, especialmente a trombose. Diversas são as fontes de proteases fibrinolíticas, porém, as fontes microbianas são as que mais se destacam em termos de baixo custo e altos índices de produção. Desde a sua produção até aplicação as enzimas precisam passar por diversos processos, o que soa negativo tornando as etapas mais custosas e tardias. Um método capaz de superar essas problemáticas é o sistema de duas fases aquosas (SDFA), processo capaz de diminuir as etapas do downstream. O objetivo deste trabalho foi produzir, purificar e caracterizar bioquimicamente a protease fibrinolítica produzida por Streptomyces parvulus DPUA 1573. A protease foi produzida por fermentação submersa utilizando resíduos ou coprodutos agroindustriais. O extrato bruto que apresentou a maior atividade enzimática (farinha da casca de maracujá) foi submetido a extração por SDFA constituído por polietilenoglicol (PEG) e sais de fosfato (potássio e sódio), seguindo um planejamento 24. Após a extração por SDFA, a protease foi submetida a purificação por cromatografia em gel filtração, e já purificada teve sua caracterização bioquímica realizada. A protease produzida por S. parvulus DPUA 1573 demonstrou atividade fibrinolítica de 15.46 U/mL e foi capaz de formar um halo de 317.31 mm2 agindo na degradação da fibrina. No SDFA, a protease fibrinolítica particionou preferencialmente para a fase rica em PEG. O melhor ensaio selecionado de acordo com a combinação do maior índice de atividade específica, fator de purificação e rendimento na atividade foi o 16, composto por PEG 8.000 gmol-1, 17,5 v/v de PEG, pH 8,0 e 15 v/v de sais de fosfato. A atividade proteásica da enzima foi muito estimulada na presença do ferro, chegando a um aumento de 55% na atividade, e drasticamente diminuída diante o inibidor de proteases 2-mercaptoethanol (91%). A temperatura e o pH ótimo para a atividade enzimática foram 40ºC e pH 7,0, respectivamente, se mantendo a atividade da enzima estável entre 30ºC e 60ºC e na faixa de pH de 7.0 a 8.5. Diante dos resultados analisados foi visto que, S. parvulus DPUA 1573 se mostrou uma boa produtora de proteases fibrinolíticas, e o sistema de duas fases aquosas PEG/Fosfato se mostrou uma ótima alternativa para a extração e pré-purificação de proteases fibrinolíticas.
Recuperação e purificação parcial de proteases colagenolíticas de tainha (Mugil liza) usando precipitação e particionamento em sistemas de fases
(2020-02-03) Costa, Beatriz de Aquino Marques da; Porto, Ana Lúcia Figueiredo; http://lattes.cnpq.br/4989617783837981; http://lattes.cnpq.br/2650705679652460
As protases desempenham um papel importante no campo dos estudos de biotecnologia, razão pela qual a pesquisa por fontes alternativas é altamente desejável. Assim, aliar técnicas de extração, recuperação e purificação a fontes alternativas, como subprodutos da cadeia produtiva da pesca, a fim de gerar o menor dano possível ao meio aquático é rentável para o mercado global de enzimas. Portanto, o objetivo do presente trabalho é recuperar parcialmente e purificar proteases colagenolíticas de vísceras digestivas de Tainha (Mugil liza) com potencial aplicação biotecnológica. Para isso, o extrato de vísceras digestivas (intestino, fígado e uma mistura de várias vísceras) foi precipitado utilizando sulfato de amônio. Além disso, as vísceras intestinais foram submetidas à partição por um Sistema Aquoso de Duas Fases (SDFA) e um Sistema de Partição Trifásica (TPP), a fim de avaliar as condições mais benéficas para a purificação de proteases colagenolíticas. Os resultados obtidos demonstram que, para precipitação com sulfato de amônio, os melhores resultados do Fator de Purificação ocorreram nas concentrações de 30-60% para todos os extratos avaliados (intestino, fígado e mix); o sistema bifásico aquoso (PEG/Citrato) realizado com extrato de vísceras intestinais de tainha demonstra que as condições: PEG de 8000 g/mol de massa molar; concentração de 20% de PEG; A concentração de 15% de citrato leva ao fator de purificação mais alto. Observa-se também que as colagenases tendem a migrar para a fase rica em PEG; para o sistema trifásico a maior taxa de recuperação da protease colagenolítica foi observada na proporção de 1:0,5, obtendo recuperação de 240,01% e fator de purificação de 2,55. Assim, conclui-se que os ensaios podem ser utilizados na recuperação de biomoléculas de resíduos sólidos orgânicos negligenciados da indústria pesqueira.