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Análise da Influência do número de cópias na expressão do gene blaKPC
(2021-03-05) Oliveira, Michelly Maria Pereira e; Almeida, Anna Carolina Soares; http://lattes.cnpq.br/4153747599532886
As enterobactérias tem se destacado na prática clínica pela detecção de mecanismos enzimáticos que conferem resistência a antimicrobianos, destacando-se a Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) devido a sua rápida disseminação mundial ocasionada pela localização do gene blaKPC em grandes plasmídios transferíveis e transposons. A expressão do gene blaKPC pode ser afetadas por características intrínsecas do hospedeiro que o abriga ou número de cópias. Um fenótipo não usual foi observado em isolados clínicos de P. stuartii e M. morganii e seus respectivos transformantes, onde as células de E. coli receptoras de plasmídeos que carregavam o gene blaKPC, apresentaram valores de CIMs, para alguns beta-lactâmicos, maiores do que nos isolados clínicos. O objetivo deste trabalho foi analisar o número de cópias do gene blaKPC, relacionando-os com seus os respectivos CIMs. O DNA genômico dos isolados bacterianos foi extraído a partir do kit PromegaTM WizardTM Genomic DNA Purification conforme orientações do fabricante, e em seguida, foi quantificado por espectofotometria através do equipamento NanoDropTM Lite da Thermo Fisher Scientific. Os genes de controle endógenos foram escolhidos a partir da literatura depois de uma busca robusta, em seguida foram analisados in silico. Utilizando bancos de dados, softwares e outras ferramentas, os primers foram desenhados. Para a realização da quantificação absoluta, foi realizada uma estimativa baseada em uma proporção da relação quantitativa relativa entre alvo e o controle endógeno, utilizando a fórmula 2-ΔCq. Para os experimentos foi utilizando o equipamento SteponeTM Real-time PCR System (Applied Biosystems) e o corante SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Os primers desenhados passaram por uma etapa de validação visando avaliar sua eficiência (tufMm - 93.019, tufPs - 90.228 e tufKp - 103.474, ambos com R2próximos de 1). Os dados gerados pelos experimentos de qPCR absoluta foram associados com os distintos perfis fenotípicos observados e a partir dos ensaios foi determinado que o número de cópias do gene blaKPC para os isolados transformantes e para os isolados clínicos não variam significativamente, apontando que outro mecanismo deve estar interferindo na expressão do gene blaKPC, influenciando diretamente os níveis de resistência.
Análise da suceptibilidade aos antimicrobianos em Pseudomonas spp. isoladas de produtos saneantes
(2020-02-03) Vitor, Mizânia Cabral de Almeida; Almeida, Anna Carolina Soares; Souza, Paula Mariana Salgueiro de; http://lattes.cnpq.br/6281410502740086; http://lattes.cnpq.br/4891800920829895
O objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes tipos de produtos saneantes, identificando a presença de microrganismos oportunistas patogênicos, em especial Pseudomonas, e conhecer a suscetibilidade aos antimicrobianos. Foram coletadas amostras durante setembro de 2019 e janeiro de 2020 para isolamento de possíveis microrganismos patogênicos oportunistas e a partir destes, foram realizados testes com 7 antimicrobianos, sendo eles amicacina, ceftazidima, cefepime, gentamicina, imipenem, aztreonam e polimixina, através do método disco-difusão. Foram recuperadas 17 cepas ao longo do estudo, que apresentaram sensibilidade à maioria dos antimicrobianos citados. Uma das cepas de Pseudomonas spp., apresentou resistência a cefepime e três cepas apresentaram resistência a amicacina.
Análise de mecanismos de resistência a polimixina em isolados de Klebsiella pneumoniae
(2021-12-17) Andrade, Rauana Lins de; Almeida, Anna Carolina Soares; Santos, Bárbara Nazly Rodrigues; http://lattes.cnpq.br/4795529090461229; http://lattes.cnpq.br/4891800920829895; http://lattes.cnpq.br/8836137133949593
As Infecções por Klebsiella pneumoniae produtora de carbapenemase têm sido um problema de saúde pública levando ao aumento da morbidade e mortalidade de pacientes, o que levou a reintrodução de um antimicrobiano previamente descontinuado para uso humano, as polimixinas. O aumento da resistência às polimixinas tem dificultado ainda mais o tratamento, o que é preocupante devido à alta disseminação mundial dessas cepas. Este estudo teve como objetivo realizar a análise genética dos sistemas de dois componentes envolvidos na resistência a polimixina em isolados de Klebsiella pneumoniae. Foram estudados 16 isolados de K. pneumoniae multirresistentes. A relação clonal foi realizada a partir da investigação de sequências palindrômicas extragênicas repetidas (REP). Os genes dos sistemas reguladores enzimáticos de dois componentes (pmrA, pmrB, phoP, phoQ) foram amplificados por reação em cadeia da polimerase (PCR). A identificação das mutações foi realizada por sequenciamento de DNA com análise comparativa utilizando a cepa MGH 78578 como referência. Foi possível distinguir a presença de quatro grupos com relação clonal da mesma espécie com variação de 2 a 5 bandas não compartilhadas, indicando um padrão de similaridade entre todas as bactérias do estudo. Todos os isolados apresentaram mais de uma mutação nas regiões codificantes dos genes estudados, a prevalência foi de mutações classificadas como silenciosas em pmrA e phoP. Porém mutações do tipo Frameshift Nonsense e Missense foram identificadas, nos genes pmrB e phoQ o que levou a alterações na cadeia de aminoácidos e produção de uma proteína não funcional. As alterações nucleotídicas nas regiões codificantes dos genes reguladores dos TCS (phoPQ e pmrAB) e o comprometimento da sequência proteica, são considerados os mecanismos mais relevantes no que diz respeito a mediação da resistência às polimixinas.
Análise de mecanismos de resistência em bactérias clínicas oriundas de hospitais de Pernambuco
(2021-02-17) Silva, Jonas de Melo Silvestre da; Almeida, Anna Carolina Soares; http://lattes.cnpq.br/4891800920829895; http://lattes.cnpq.br/9044602995334190
A disseminação de bactérias resistentes ou superbactérias vem sendo considerada uma ameaça catastrófica para a saúde da população e representa um dos principais desafios na área da saúde em todo o mundo. O objetivo principal deste trabalho é a identificação dos determinantes genéticos, moleculares, mecanismos de resistência e a relação clonal entre vinte e dois isolados obtidos de dois hospitais de Pernambuco. Foram incluídos isolados de: Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae, Escherichia coli e Enterobacter spp, onde todos apresentaram perfil fenotípico de resistência a multidrogas (MDR). Os isolados provenientes do Hospital Universitário da Universidade Federal do Vale do São Francisco apresentaram perfil de resistência mais alto em relação aos isolado do Hospital Universitário Oswaldo Cruz localizado em Recife, principalmente a aminoglicosídeos e cefalosporina 3º e 4º geração. Pela técnica de Reação em cadeia da polimerase (PCR) foi possível detectar pelo menos um dos genes resistência B-lactâmico a testados em todos os isolados, com exceção de 2 isolados que não apresentaram nenhum dos genes avaliados. O gene blaCTX-M foi o mais prevalente encontrado nesse estudo. E apesar de metade das amostras terem perfil de resistência a carbapenêmicos, o gene blaKPC foi o menos detectado. Além disso, pela análise de relação clonal através da técnica REP-PCR revelou uma possível endemicidade de um único tipo clonal na Unidade de Terapia Intensiva no Hospital Universitário Oswaldo Cruz localizado em Recife. Já no Hospital Universitário da Universidade Federal do Vale do São Francisco foi identificado estabelecimento de dois grupos clonais que estão disseminados a pelo menos 3 meses. A presença de bactérias multirresistentes em unidades hospitalares reforça a necessidade de estratégias para contenção de infecções e da disseminação desses patógenos, principalmente nas UTIs.
Análise in silicode iniciadores de genes referência utilizados como normalizadores em estudos utilizando qPCR para avaliação da expressão de isolados de Klebsiella pneumoniae
(2019) Fonseca, Bárbara Schneyder Oliveira Pereira da; Almeida, Anna Carolina Soares; Nascimento, Crisvânia Pedrosa dos Santos; http://lattes.cnpq.br/9308656350291661; http://lattes.cnpq.br/4891800920829895; http://lattes.cnpq.br/0924501124844316
A Klebsiella pneumonia e é uma bactéria patogênica considerada “uma ameaça urgente à saúde humana”, pois é crescente o número de relatos de bactérias resistentes aos antibióticos, principalmente aos considerados de última linha para seu tratamento, como a colistina. Com isso, se faz necessário o entendimento de seus mecanismos de resistência, para saber as melhores formas de tratamento e desenvolver novas drogas para trataras infecções. Para isso a PCR quantitativa em tempo real em estudos de expressão relativa se tornou uma das ferramentas mais eficazes a fim de compreender o funcionamento bacteriano a nível transcricional, porém para que os resultados sejam confiáveis e reais é necessária a realização da etapa de normalização, que dentre os possíveis o mais comum é por meio do uso de genes de referência. Porém a escolha dos genes a serem utilizados como normalizadores dentre os genes apontados pela literatura tem se mostrado controversa e, em muitos casos, com pouca confiabilidade. Essa dificuldade seria eliminada se houvesse um banco de dados robusto, para diversos tipos de estudos para espécies além de humanos e ratos. Assim, surgiu a necessidade de avaliar dentre os estudos expressão gênica bacteriana utilizando a qPCR, os genes utilizados como normalizadores e os iniciadores utilizados para amplificá-los. Em uma análise da literatura, disponível no Pubmed, os genes 16Se rpoB foram os mais usados como normalizadores. Através de análises in silico feitas após a análise de literatura foi possível observar que de 38 sequências de pares de iniciadores analisados apenas quatro estavam dentro do padrão ideal sendo os melhores a serem utilizados em pesquisas posteriores, dentre as quatro apenas uma era referente a um dos genes mais utilizados, o 16S.
Diversidade genética e mecanismos moleculares de resistência à polimixina b em Klebsiella pneumoniae proveniente de isolados de Recife, Pernambuco: uma revisão sistemática
(2023-09-15) Silva, Patrícia Francisca Gama da; Almeida, Anna Carolina Soares; http://lattes.cnpq.br/4891800920829895; http://lattes.cnpq.br/1512465502025161
A resistência bacteriana aos antimicrobianos tornou-se um problema de saúde pública nos últimos anos, devido às limitações terapêuticas de combate a essas infecções. Com a necessidade de tratar as infecções causadas por esses patógenos, a polimixina B, droga de último recurso, foi reintroduzida na clínica médica. Visando entender quais mecanismos estão associados ao fenótipo de resistência à polimixina B e como tem ocorrido a disseminação dessa resistência, esta revisão sistemática reuniu achados de outros estudos que investigaram isolados de Klebsiella pneumoniae resistentes à polimixina B provenientes de hospitais da cidade do Recife, Pernambuco. Os dados obtidos revelam que existe uma correlação da resistência à polimixina B associada à interrupção do gene mgrB, regulador negativo de PhoQ. Quanto aos genes envolvidos nos sistemas de dois componentes, o gene pmrB foi o que apresentou prevalência de mutações. Além da resistência à polimixina B, todos os isolados apresentam outros genes de resistência associados a uma variedade de drogas, sendo o mais incidente os genes de resistência aos β-lactâmicos: blaKPC, blaTEM, blaSHV, blaCTX-M. A associação desses isolados com base nos perfis filogenéticos nos permitiu observar a ocorrência de disseminação policlonal, com prevalência das ST855 e ST423, presentes em mais de um recorte temporal analisado.
Epidemiologia molecular de infecções por Klebsiella pneumoniae em Pernambuco, Brasil
(2024-03-04) Santana, Laís Guedes de; Almeida, Anna Carolina Soares; Souza, Paula Mariana Salgueiro de; http://lattes.cnpq.br/6281410502740086; http://lattes.cnpq.br/4891800920829895; http://lattes.cnpq.br/3501081040611239
FUNDAMENTOS A emergência de Klebsiella pneumoniae resistentes a múltiplas drogas aumenta a taxa de mortalidade, tornando sua disseminação preocupante em contextos clínicos. OBJETIVOS Analisar a disseminação de K. pneumoniae e os desfechos clínicos de infecções causadas por esse patógeno. MÉTODOS Foram incluídos 25 isolados de K. pneumoniae provenientes de infecções de pacientes únicos de um hospital localizado em Recife-PE. Vitek2® foi utilizado para identificação e perfil de susceptibilidade das cepas. Os dados epidemiológicos dos pacientes foram coletados dos prontuários médicos. Os principais genes relacionados à resistência aos β-lactâmicos foram investigados por PCR convencional. A análise da relação filogenética entre os isolados foi feita utilizando REP-PCR. RESULTADOS Mais da metade dos isolados apresentaram resistência in vitro a pelo menos um antibiótico pertencente à classe dos β-lactâmicos. Quarenta e quatro por cento dos pacientes foram expostos a antimicrobianos antes dos testes de susceptibilidade serem disponibilizados. A investigação dos determinantes de resistência aos β-lactâmicos revelou a presença de pelo menos uma β-lactamase em todos os isolados analisados.A análise filogenética, baseada nas sequências REP, não indica uma disseminação clonal específica. PRINCIPAIS CONCLUSÕES Os resultados indicam um desafio significativo com a resistência antimicrobiana em K. pneumoniae. A exposição a diversos antimicrobianos contribui para o desenvolvimento de cepas resistentes. Nesse contexto, a necessidade de identificação correta e rápida dos mecanismos de resistência antimicrobiana nas unidades de saúde são essenciais para conter a disseminação.
Uso da urocultura para predizer a hemocultura no diagnóstico etiológico de urosepse
(2023-09-11) Ferreira, Karoliny Gonçalves do Amaral Ferraz; Almeida, Anna Carolina Soares; Pereira, Jennifer Sabrina Ferreira da Silva; http://lattes.cnpq.br/0520318508510990; http://lattes.cnpq.br/4891800920829895; http://lattes.cnpq.br/3030973842702888
A urocultura e a hemocultura são exames cruciais para identificar os agentes patológicos, responsáveis pela infecção, e guiar o tratamento adequado. No entanto, os resultados da hemocultura frequentemente requerem mais de um dia, atrasando o tratamento e apresentando altas taxas de falso negativo. Estudos sugerem que os resultados da urocultura podem ser usados para predizer os resultados da hemocultura em pacientes com urosepse, agilizando diagnósticos. O propósito deste estudo foi analisar os dados de urocultura e hemocultura em hospitais terciários no Recife, com o objetivo de avaliar a urocultura como uma ferramenta adicional e eficaz para diagnosticar urosepse, visando a redução do tempo de internação e a garantia de tratamento apropriado. Os dados foram examinados considerando fatores como gênero biológico e patógenos mais frequentes contribuindo para o entendimento da sepse e o aprimoramento do diagnóstico de urosepse. O estudo analisou 842 pedidos de exames de pacientes internados entre janeiro de 2022 e janeiro de 2023, que realizaram tanto urocultura quanto hemocultura. Pacientes que fizeram exames de urocultura e hemocultura simultaneamente, com pelo menos um resultado positivo, foram selecionados. Cerca de 40,1% desses pacientes tiveram resultados positivos para ambos os exames. A correlação revelou uma probabilidade mais limitada de ambos os exames serem positivos, com a hemocultura apresentando mais casos de possíveis falsos negativos. Casos em que o mesmo agente patológico foi evidenciado em ambos os exames, onde estes tenham sidos realizados no mesmo dia também foram investigados, visto que se fosse identificado um alto índice destes casos, seria possível que o exame de urocultura predissesse o exame de hemocultura. Porém, apenas 4,2% desses casos sustentaram a hipótese proposta. O sexo feminino mostrou maior positividade, concordando com pesquisas anteriores sobre infecções urinárias e sepse. A Escherichia coli foi o patógeno mais prevalente, seguido pela Klebsiella pneumoniae, corroborando com a literatura. Além disso, 38,3% dos pacientes com resultados positivos em uroculturas tiveram resultados negativos em hemoculturas, indicando possíveis falsos negativos nas hemoculturas, conforme identificado em estudos anteriores. Portanto, considerando as evidências reunidas, a utilização da urocultura como preditora da hemocultura no diagnóstico de urosepse não demonstrou eficácia comprovada. Isso implica que, embora a urocultura possa indicar a presença de agentes infecciosos no trato urinário, não é capaz de predizer diretamente a presença de bactérias na corrente sanguínea, uma vez que os agentes etiológicos nos pacientes com resultados positivos em ambos os exames, na maioria das vezes, foram diferentes.