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Avaliação da produção de endotoxinas por Bacillus thuringiensis cultivado com substratos agroindustriais
(2019-12-13) Freitas, Lívia Santos de; Porto, Ana Lúcia Figueiredo; http://lattes.cnpq.br/4989617783837981; http://lattes.cnpq.br/3952630035656313
Em contrapartida ao uso exacerbado de pesticidas químicos, o controle biológico de pragas não acarreta danos socioambientais, além de ser altamente específico e eficiente. Um dos agentes biológicos amplamente utilizado é a bactéria Bacillus thuringiensis (Bt), que se caracteriza por produzir cristais proteicos, denominados de delta-endotoxinas, que apresentam alta toxicidade e especificidade para vários membros de Lepidoptera, Diptera, Coleoptera. Bt pode ser cultivado em diferentes tipos de meios de cultura, sendo fundamental a utilização de substratos menos onerosos a fim de baratear o produto final. Assim, visando desenvolver meios de cultura de baixo custo, o presente trabalho utilizou o extrato de palma forrageira (Opuntia), o xarope de sorgo (Sorghum) e o soro de leite como substratos alternativos para o cultivo de B. thuringiensis var. berliner 370 (Btb370). A necessidade de suplementação de nitrogênio foi avaliada através da adição de ureia 1 g/L. O meio de cultura Luria-Bertani líquido foi usado como meio de controle. Os meios de cultura foram submetidos a agitador rotativo a 200 rpm, 30 °C por 96 horas e foram avaliados o crescimento celular e a produção de delta-endotoxinas, esporos e proteases por Btb370. Além disso, houve também a análise morfológica dos cristais proteicos de Btb370 através de microscopia eletrônica de varredura. Observou-se que o meio à base de soro de leite sem a adição de ureia 1 g/L foi o que apresentou maior crescimento celular (4,28 g/L) e maior produção de delta-endotoxinas (568,26 μg/mL) e esporos (9,61 x 1010 UFC/mL) pela bactéria, superiores inclusive ao meio de controle. Os meios constituídos por xarope de sorgo e soro de leite sem suplementação de ureia proporcionaram os maiores valores de atividade proteásica (6013 U/mL e 5962 U/mL, respectivamente). Os meios à base de extrato de palma forrageira não apresentaram produção mensurável de delta-endotoxinas por Btb370. As morfologias dos cristais proteicos observadas foram: bipiramidal, esférica e cuboidal. Desta forma, verifica-se que o soro de leite foi o substrato mais eficiente para o crescimento, esporulação e produção de delta-endotoxinas por Bacillus thuringiensis var. berliner 370.
Avaliação de métodos de manutenção de Bacillus thuringiensis var. israelensis
(2018) Xavier, Ana Carolina Cavalcante; Porto, Ana Lúcia Figueiredo; Oliveira, José de Paula; http://lattes.cnpq.br/3540150611094753; http://lattes.cnpq.br/4989617783837981; http://lattes.cnpq.br/4483834181760838
Devido a crescente poluição ambiental e aumento de casos de problemas de saúde pelo uso indiscriminado de pesticidas químicos, inseticidas a base de Bacillus thuringiensis vem sendo amplamente utilizado como um método alternativo de combate a pragas e vetores. Bacillus thuringiensis (ou Bt) é uma bactéria produtora de inclusões proteicas cristalinas que são tóxicas a várias espécies de insetos vetores e pragas, e inócuas aos seres humanos e animais. A manutenção adequada deste micro-organismo é fundamental para o sucesso das formulações, para tanto, o método deve garantir o maior rendimento de biomassa e deve ainda as proteínas por ele produzidas. Os métodos mais utilizados de manutenção são com o Bt mantido na superfície de discos de papel, em pellet congelado, repicagens contínuas, com a cultura liofilizada, e com a cultura mantida submersa em óleo mineral. Este trabaho teve por objetivo determinar o método que proporciona maior rendimento de biomassa bacteriana. Assim sendo, avaliou-se neste trabalho três métodos de manutenção de Bacillus thuringiensis var. israelensis (cepa H-14/ IPA-CAV-Bti-0008): em discos de papel, por congelamento do pellet a -20 °C e sob óleo mineral. Foram realizados cultivos em biorreator operando em batelada descontínua para cada um dos métodos avaliados. Amostras foram retiradas a cada duas horas para determinação da curva de crescimento do micro-organismo por densidade óptica (D.O). Os parâmetros analisados de pH, oxigênio dissolvido foram monitorados automaticamente por meio de eletrodos acoplados ao equipamento e inseridos no cultivo. O rendimento total da biomassa bacteriana foi determinado por meio do processo de floculação/sedimentação, com posterior secagem e determinação da massa seca. Ao final dos cultivos realizou-se uma eletroforese em gel de poliacrilamida para verificar o perfil das proteínas produzidas pelo bacilo em cada um dos três métodos. Obtevese que o método de preservação em óleo mineral foi o mais eficiente no que concerne o maior rendimento de biomassa, apesar de os métodos de manutenção em disco de papel e do pellet congelado terem a vantagem de necessitar de menor espaço de armazenamento, risco de contaminação e custo.
Biorremediação de corantes azo por cepas de Aspergillus isoladas do solo da caatinga
(2023-04-19) Oliveira, Adriane Caroline Batista; Porto, Ana Lúcia Figueiredo; http://lattes.cnpq.br/4989617783837981; http://lattes.cnpq.br/3498440662001137
Nos últimos anos, a quantidade de efluentes têxteis descartados em corpos d’água tem aumentado gradativamente. Devido a compostos altamente tóxicos em sua composição, a presença de corantes entre esses compostos causam impactos prejudiciais ao meio ambiente por apresentarem difícil degradação, reduzir a atividade fotossintética nos corpos d’água, e apresentar potencial bioacumulativo. Dessa maneira, o tratamento de águas residuais utilizando a biorremediação surge como uma alternativa de remoção desses compostos. Este trabalho sugere uma alternativa ecológica para remoção de azo corantes, utilizando biomassa de fungos Aspergillus como mecanismo de descoloração dos azo corantes Congo Red, Direct Black 22 e Amido Black. Foi realizada uma seleção de fungos empregando 1g e 3g de biomassa viva das cepas Aspergillus sp. UCP 1280, Aspergillus sp. UCP 1281 e Aspergillus sp. UCP 1285 com duração de 3 horas de experimentação, sob condições de pH 7, 30°C de temperatura e 120 RPM. Os melhores resultados de descoloração, para os três corantes e com os três fungos foram alcançados quando empregado 3 g de biomassa. E o fungo que melhor descoloriu os corantes foi o Aspergillus sp. UCP 1281, que demonstrou taxas acima de 95%, 90%, 50% de descoloração para o Congo Red, Direct Black 22 e Amido Black, respectivamente. Para medir a capacidade de reutilização da biomassa e recuperação dos corantes foram aplicados como dessorventes Dimetilsulfóxido (DMSO), Ácido acético e Bicarbonato de sódio. E para todos os fungos e corantes, as melhores dessorções foram observadas com DMSO e bicarbonato, provavelmente devido ao pH básico desses eluentes. Todos os fungos testados apresentaram resultados positivos para o teste qualitativo de lacase, indicando possibilidade de degradação de corantes azo com essas cepas. Esses resultados mostram que Aspergillus apresenta alto potencial para remoção de azo corantes, mesmo com concentrações diferentes de biomassa e com estruturas químicas complexas dos corantes, mas é necessário o desenvolvimento de mais pesquisas envolvendo a capacidade dessas cepas para o tratamento de azo corantes, possibilitando uma aplicação com maior escalabilidade e parâmetros otimizados para garantir a maior eficiência da descoloração.
Estudo in vitro de avaliação da eficácia de novos compostos derivados de triazol frente a cepas sensíveis de Mycobacterium tuberculosis
(2021-07-15) Rodrigues, Danielle Martiniano da Silva; Porto, Ana Lúcia Figueiredo; Pimentel, Lílian Maria Lapa Montenegro; http://lattes.cnpq.br/6066865382706623; http://lattes.cnpq.br/4989617783837981; http://lattes.cnpq.br/3260001484566380
A tuberculose é uma doença infectocontagiosa responsável por um alto número de casos em todo o mundo. Provocada pela espécie Mycobacterium tuberculosis, é transmitida de pessoa a pessoa através da via aérea, pela inalação de bacilos provindos de um indivíduo infectado, apresentando baciloscopia positiva. O tratamento convencional consiste no uso de quatro fármacos de primeira linha: rifampicina, etambutol, isoniazida e pirazinamida. Em decorrência da baixa aderência terapêutica, o mundo enfrenta atualmente uma grande problemática de resistência bacteriana, que dificulta o tratamento, tornando-o mais tóxico e longo, podendo durar por até dois anos. Em razão disso, faz-se necessário o desenvolvimento de novas moléculas, capazes de eliminar o bacilo causador da tuberculose de forma rápida e com baixo ou nenhum efeito adverso para serem utilizadas no tratamento. Grande parte dos medicamentos utilizados atualmente são compostos por estruturas heterocíclicas, assim como muitos compostos em desenvolvimento que apresentam resultados promissores. Em especial uma classe de compostos, os triazóis, que possuem ampla aplicação biológica. Sendo assim, o presente trabalho teve o objetivo de avaliar compostos heterocíclicos derivados de triazóis contra cepas sensíveis de Mycobacterium tuberculosis, como candidatos a novas moléculas para o tratamento da tuberculose, através de estudos da atividade biológica in vitro. Foi avaliado o índice de concentração inibitória mínima e a citotoxicidade em linhagem macrofágica Raw 264.7 e hepatócitos HepG2 de compostos derivados de triazol, bem como o tipo de interação que estes apresentam com fármacos de primeira linha para o tratamento da tuberculose. Todos os compostos apresentaram baixa a relevante atividade contra o bacilo, com CIM variando de 64 a 4 μg/ml para cepa H37Rv e de >64 a 8 μg/ml para cepa H37Ra. Os compostos com melhores resultados foram A48 e A51, selecionados para avaliação da atividade do índice de concentração inibitória fracionada, com os fármacos rifampicina e etambutol, em que ambos se mostraram indiferentes. Os resultados obtidos neste estudo indicam a ação inibitória micobacteriana dos derivados de triazol avaliados, como possíveis agentes farmacológicos, oferecendo parâmetros para o seguimento de testes in vitro.
Produção de lacases por Aspergillus serratalhadensis URM 79/18 utilizando subprodutos agroindustriais
(2022-10-05) Ferreira, Julyanne Victória dos Santos; Porto, Ana Lúcia Figueiredo; Batista, Juanize Matias da Silva; http://lattes.cnpq.br/6699725036732885; http://lattes.cnpq.br/4989617783837981; http://lattes.cnpq.br/8901230412759036
As lacases são enzimas ligninolíticas que contém cobre, sendo conhecidas por serem ótimos agentes oxidantes na presença de oxigênio. Dentre as enzimas ligninolíticas, as lacases são o grupo mais amplamente estudado, sendo conhecidas como catalisadores verdes, pois promovem a redução direta do oxigênio molecular à agua sem a formação de subprodutos indesejados. Atualmente as lacases são secretadas principalmente por fungos dos filos Ascomycota e Basidiomycota e possuem uma diversidade de aplicações industriais que incluem a descoloração e degradação de corantes e efluentes têxteis, detergentes para alvejamentos de tecidos, branqueadores dentais para higiene oral, branqueamento de celulose na indústria de tecidos e de papel e na desconstrução da biomassa lignocelulósica. Sendo assim, o presente estudo objetivou a produção de lacases pela fermentação em estado sólido (FES) e submersa (FS) do Aspergillus serratalhadensis URM 79/18, um microrganismo isolado do solo da Caatinga, utilizando como substratos os resíduos agroindustriais, farelo de trigo, farinha de soja, casca de macaxeira e de laranja. O teste qualitativo realizado pela adição de 3 Mm do substrato ABTS ao meio BDA foi positivo para produção extracelular de lacase, sendo confirmado pela formação de um halo na coloração verde medindo cerca de 34 mm. O substrato da casca de laranja utilizado na FES inibiu o crescimento fúngico até o tempo de 96h de fermentação, e consequentemente não houve produção enzimática com este substrato. A atividade de lacase foi determinada usando ABTS como substrato, assim, a maior atividade enzimática foi de 305,56 U/mL obtida após 48h de FES a 30°C no substrato de farelo de trigo, a segunda maior produção de lacase foi de 296,29 U/mL também oriunda da FES, porém no substrato da casca de macaxeira e com tempo de 72h de fermentação. Para a FS foi utilizado o meio MS-2 modificado pelo uso do ABTS como indutor e também pela solução nutritiva contendo diversos íons metálicos, os substratos usados foram o farelo de trigo e a farinha de soja no tempo de fermentação de 48h sendo a maior atividade de lacase na FS obtida com o meio MS-2 modificado pela solução nutritiva e pela adição de ABTS, sendo de 0,1944 U/mL tendo o farelo de trigo como substrato. Portanto, a recente linhagem fúngica A. serratalhadensis é produtora de lacase e tem desempenho ideal na fermentação em estado sólido, sobretudo quando utilizado como substrato o resíduo agroindustrial de farelo de trigo, demonstrando o seu potencial para indústria biotecnológica
Produção de proteases por Aspergillus ochraceus URM 604 obtidas por fermentação em estado sólido utilizando farelo de trigo e resíduo de café como substrato
(2021-03-03) Santos, Amanda Lucena dos; Porto, Ana Lúcia Figueiredo; Cardoso, Kethylen Barbara Barbosa; http://lattes.cnpq.br/4784303425329040; http://lattes.cnpq.br/4989617783837981; http://lattes.cnpq.br/3697084385877618
Proteases são enzimas de grande interesse comercial, tendo aplicações em diferentes segmentos industriais, como o farmacêutico, de alimentos, bebidas e produtos de limpeza. Dentre os organismos capazes de produzir essas enzimas estão os fungos filamentosos, os quais apresentam como vantagens a possibilidade de secretarem enzimas de forma extracelular e de crescerem em substratos de baixo custo. A Fermentação em Estado Sólido (FES) é uma das técnicas preconizadas no cultivo desses organismos, especialmente por simular o habitat natural dos fungos, favorecendo o seu crescimento. Tendo em vista a importância das proteases e a crescente demanda do mercado global, faz-se necessário a busca por novas fontes e métodos de produção. Neste sentido, o objetivo desse trabalho foi produzir proteases sob FES pelo fungo Aspergillus ochraceus URM 604 utilizando substratos derivados da agroindústria. Foi estudado através de um planejamento fatorial 2³ a influência do tipo de substrato (resíduo de café, farelo de trigo e 1:1 café + farelo de trigo), quantidade de substrato (3g, 5g e 7g) e umidade (20, 40 e 60%) condições essenciais para a produção de proteases. A fermentação ocorreu por 7 dias a 30°C e o extrato metabólico foi utilizado para posteriores análises. Nas análises bioquímicas e físicas foram determinadas a atividade proteásica, proteínas totais, temperatura e pH ótimo das enzimas obtidas. Ao analisar a influência das variáveis adotadas no planejamento fatorial 2³ foi constatado que somente o tipo de substrato foi significativo. O melhor substrato foi o farelo de trigo que apresentou atividade enzimática específica de 218.27 U/mg sob as condições de 3g de substrato e 60% de umidade. As demais condições também apresentaram resultados elevados quando comparado a literatura. A temperatura ótima da enzima produzida foi de 50°C e o pH ótimo foi pH 8-9 (protease alcalina). Dessa forma, o presente trabalho demonstra que o fungo A. ochraceus URM 604 tem potencial biotecnológico para produção de protease sob FES utilizando substratos de baixo custo como resíduo de café e farelo de trigo, sendo este o primeiro relato para a espécie.
Recuperação e purificação parcial de proteases colagenolíticas de tainha (Mugil liza) usando precipitação e particionamento em sistemas de fases
(2020-02-03) Costa, Beatriz de Aquino Marques da; Porto, Ana Lúcia Figueiredo; http://lattes.cnpq.br/4989617783837981; http://lattes.cnpq.br/2650705679652460
As protases desempenham um papel importante no campo dos estudos de biotecnologia, razão pela qual a pesquisa por fontes alternativas é altamente desejável. Assim, aliar técnicas de extração, recuperação e purificação a fontes alternativas, como subprodutos da cadeia produtiva da pesca, a fim de gerar o menor dano possível ao meio aquático é rentável para o mercado global de enzimas. Portanto, o objetivo do presente trabalho é recuperar parcialmente e purificar proteases colagenolíticas de vísceras digestivas de Tainha (Mugil liza) com potencial aplicação biotecnológica. Para isso, o extrato de vísceras digestivas (intestino, fígado e uma mistura de várias vísceras) foi precipitado utilizando sulfato de amônio. Além disso, as vísceras intestinais foram submetidas à partição por um Sistema Aquoso de Duas Fases (SDFA) e um Sistema de Partição Trifásica (TPP), a fim de avaliar as condições mais benéficas para a purificação de proteases colagenolíticas. Os resultados obtidos demonstram que, para precipitação com sulfato de amônio, os melhores resultados do Fator de Purificação ocorreram nas concentrações de 30-60% para todos os extratos avaliados (intestino, fígado e mix); o sistema bifásico aquoso (PEG/Citrato) realizado com extrato de vísceras intestinais de tainha demonstra que as condições: PEG de 8000 g/mol de massa molar; concentração de 20% de PEG; A concentração de 15% de citrato leva ao fator de purificação mais alto. Observa-se também que as colagenases tendem a migrar para a fase rica em PEG; para o sistema trifásico a maior taxa de recuperação da protease colagenolítica foi observada na proporção de 1:0,5, obtendo recuperação de 240,01% e fator de purificação de 2,55. Assim, conclui-se que os ensaios podem ser utilizados na recuperação de biomoléculas de resíduos sólidos orgânicos negligenciados da indústria pesqueira.