UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO UNIDADE ACADÊMICA DE SERRA TALHADA CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS LARISSA CELESTINO DA SILVA ANÁLISE ESTRUTURAL E USO DE LACASE DE CAMARÃO PARA A DEGRADAÇÃO DE ANTRACENO MONOGRAFIA SERRA TALHADA - PE 2022 2 LARISSA CELESTINO DA SILVA ANÁLISE ESTRUTURAL E USO DE LACASE DE CAMARÃO PARA A DEGRADAÇÃO DE ANTRACENO Monografia apresentada ao Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas da Universidade Federal Rural de Pernambuco, Unidade Acadêmica de Serra Talhada (UFRPE/UAST), em exigência a aquisição do título de Bacharel em Ciências Biológicas. Orientador: Prof. Dr. Diego de Souza Buarque SERRA TALHADA – PE 2022 3 4 LARISSA CELESTINO DA SILVA ANÁLISE ESTRUTURAL E USO DE LACASE DE CAMARÃO PARA A DEGRADAÇÃO DE ANTRACENO Monografia apresentada ao Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas da Universidade Federal Rural de Pernambuco, Unidade Acadêmica de Serra Talhada (UFRPE/UAST), em exigência a aquisição do título de Bacharel em Ciências Biológicas. Orientador: Prof. Dr. Diego de Souza Buarque BANCA EXAMINADORA: Prof. Dr. Diego de Souza Buarque Prof. Adjunto da UFRPE (Unidade Academica de Serra Talhada) 1° titular (Presidente) Prof. Dr. Rogério de Aquino Saraiva Prof. Adjunto da URCA (Universidade Regional do Cariri) 2° titular Prof. Dr. Airton Torres Carvalho Prof. Adjunto da UFERSA (Universidade Federal Rural do Semi-Árido) 3° titular 5 Dedico este trabalho à minha família, em especial, aos meus pais Francisco Celestino e Maria do Socorro pela presença constante em minha vida, e sobretudo, pelo apoio, incentivo e amor condicional. 6 AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar, а Deus, pela dádiva da vida e por sua presença a todo o momento, por me ouvir, abençoar e me proteger, pоr tеrpermitido que eu tivesse saúde е determinação para não desanimar durante a realização deste trabalho. A UFRPE/UAST, que no decorrer do curso foi literalmente a minha casa, pela a oportunidade de vivenciar e desfrutar da vida acadêmica, e aos professores do Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas pela dedicação e comprometimento em passar conhecimentos, os quais foram extremamente necessários para a minha formação. Ao Laboratório de Química da UFRPE/UAST, o qual foi primordial para a elaboração deste trabalho. Imensamente, ao meu Orientador Prof. Dr. Diego de Souza Buarque, pela oportunidade de ser orientada pelo mesmo, pelos conselhos, ensinamentos, incentivos, paciência, e apoio concedido durante toda a trajetória em que me orientou. Que Deus possa te devolver em alegria e chuva de bênçãos por toda dedicação e ensinamento que foram destinados a mim. Aos meus pais, por terem me ensinado os valores morais e éticos que só se aprendem em casa e por terem me apoiado e me darem forças para continuar até o fim dessa jornada. Aos meus irmãos (Liliane, Lucas e Luís) pelo apoio. As minhas amigas da graduação: Victoria Karolina, Vitória Régia, Thais, jefferson e Girlanne (companheira dos trabalhos, atividades, e que esteve comigo desde o começo, e tivemos até o prazer de dividirmos o laboratório para a realização do ESO. A minha amiga Ingrid Maria que sempre me apoiou e torceu por mim, que está comigo desde o começo e que não se cansa de encher a boca pra dizer que tem uma amiga bióloga. 7 “A mente que se abre para uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original”. Albert Einstein 8 RESUMO Por meio do grande crescimento populacional e desenvolvimento tecnológico, a utilização de recursos naturais tornou-se cada vez mais presente e constante, acarretando também preocupações, medidas e soluções referentes ao ambiente. Neste contexto, o derramamento de petróleo tem afetado os ecossistemas aquáticos. Ademais, o petróleo abrange uma série de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, os quais são pouco voláteis e se depositam no fundo dos ambientes aquáticos. Por isso, o uso de enzimas lacases pode ser utilizada para combater os hidrocarbonetos do petróleo. A estrutura da lacase de L. vannamei apresentou domínios conservados característicos dessa enzima, como aqueles que são importantes para os centros de cobre, uma vez que, os mesmos são responsáveis por realizar a oxidação dos compostos aromáticos. Além disso, a sequência dessa enzima apresentou um percentual de identidade maior quando comparada com as lacases de outros organismos, tal fato pode ser caracterizado devido ao número de posições idênticas existentes entre as sequências de aminoácidos das mesmas. O presente trabalho abordou a utilização de ferramentas de bioinformática para entender a estrutura da lacase e, consequentemente, testar a atividade da enzima na degradação do hidrocarboneto antraceno. Palavras-chave: Lacase, hidrocarbonetos, antraceno, biorremediação. 9 ABSTRACT Through the large population growth and technological development, the use of natural resources has become increasingly present and constant, also causing concerns, measures and solutions related to the environment. In this context, the oil spill has affected aquatic ecosystems. Furthermore, petroleum comprises a series of polycyclic aromatic hydrocarbons, which are not very volatile and are deposited at the bottom of aquatic environments. Therefore, the use of laccase enzymes can be used to combat petroleum hydrocarbons. The structure of the L. vannamei laccase showed conserved domains characteristic of this enzyme, such as those that are important for copper centers, since they are responsible for carrying out the oxidation of aromatic compounds. In addition, the sequence of this enzyme showed a higher percentage of identity when compared to the laccases of other organisms, this fact can be characterized due to the number of identical positions existing between their amino acid sequences. The present work addressed the use of bioinformatics tools to understand the structure of the laccase and, consequently, test the activity of the enzyme in the degradation of the anthracene hydrocarbon. Keyowrds: Laccase, hydrocarbons, anthracene, bioremediation. 10 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 - Fórmula estrutural do antraceno 18 FIGURA 2 - Principais áreas de aplicação de lacases 20 FIGURA 3 - Representação esquemática dos centros de cobre da enzima lacase 21 FIGURA 4 - Sequência FASTA de aminoácidos da lacase de Litopenaeus vannamei obtida no pubmed. Na sequência, os quatros domínios cobre-oxidases estão destacados em amarelo e um outro domínio conservado (C-X-R-X-C), encontrado perto do N-terminal da proteína está destacado em azul (em que X representa qualquer aminoácido) 26 FIGURA 5 - Alinhamento da sequência da lacase de Litopenaeus vannamei com as sequências primárias dos modelos obtidos. Em verde escuro, resíduos conservados, em verde claro, semiconservados e em amarelo claro resíduos diferentes com algumas propriedades e funções químicas semelhantes, em branco resíduos diferentes que não apresentam nenhuma propriedade química semelhante. Os traços nas sequências (--) apontam os “gaps” 28 FIGURA 6 - Acompanhamento da degradação do antraceno pela enzima lacase do camarão Litopenaeus vannamei na ausência de mediadores. A) Assim que realizado o experimento no tempo de 0 horas já ouve a degradação do antraceno de 10%. B) após o tempo de incubação de 2h ouve um aumento na taxa de oxidação chegando a 50%. C) em 48h de incubação foi possível vizualizar a maior atividade da enzima, conseguindo degradar 95% do antraceno 30 11 LISTA DE TABELAS TABELA 1 - Percentual de identidade das enzimas lacases obtidas com a enzima lacase de Litopenaeus vannamei (enzima molde) 27 TABELA 2 - Dados do respectivo hidrocarboneto sobre o qual a lacase age obtida pelo Pubchem 29 12 LISTA DE ABREVIAÇÕES ANT- Antraceno HPAS- Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos IUPAC- União Internacional de Química Pura e Aplicada 13 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 14 2. REVISÃO DE LITERATURA ..................................................................................... 16 2.1. PETRÓLEO: POTENCIAL POLUIDOR .................................................................. 16 2.2. HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS (HPAS) ........................ 17 2.3. ANTRACENO ......................................................................................................... 17 2.4. BIORREMEDIAÇÃO: SOLUÇÃO ECOLOGICAMENTE VIÁVEL ...................... 18 2.5. LACASES ................................................................................................................ 19 2.6. IMPORTÂNCIA DA BIOINFORMÁTICA NO ALINHMENTO DE SEQUÊNCIAS ....... 22 3. OBJETIVOS .................................................................................................................. 23 3.1. OBJETIVO GERAL ................................................................................................. 23 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................... 23 4. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................... 23 4.1. OBTENÇÃO E ANÁLISE DA SEQUÊNCIA DA LACASE DE LITOPENAEUS VANNAMEI ..................................................................................................................... 23 4.2. ANÁLISE DA HOMOLOGIA COM LACASES DE OUTROS ORGANISMOS ..... 24 4.3. PURIFICAÇÃO PARCIAL DA LACASE................................................................ 24 4.4. TESTE COLORIMÉTRICO DE DEGRADAÇÃO DO ANTRACENO.................... 25 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 25 6. CONCLUSÕES ............................................................................................................. 31 7. REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 32 14 1. INTRODUÇÃO Ao longo dos séculos, as atividades de exploração do meio ambiente têm sido consideradas fontes para o desenvolvimento da economia, estando assim na base das sociedades modernas (MANCINI; SALA, 2018; TOST et al., 2018). Pois, além do fato de ser uma atividade de alta rentabilidade econômica, uma vez que, é caracterizada por uma das principais atividades produtoras de matéria-prima, é também, responsável por gerarem milhares de empregos diretos e indiretos (IBRAM, 2020). Dentre as atividades de mineração, dá-se uma enfase nas atividades de mineração do petróleo, uma vez que, esse mineral têm sido muito utilizado pelas sociedades. Sendo que, essa substância é uma matéria-prima empregada na produção de plásticos, tintas, borrachas sintéticas e outros materiais (CLIFON, 2014), o mesmo está presente em produtos cosméticos, brinquedos, remédios, produtos de limpeza, asfalto etc. Ainda que, várias sejam as contribuições da atividade de mineração, esta também causa significativa degradação ambiental (TOST et al., 2018; RANJAN, 2019). Essas atividades acarretam riscos ambientais para a área em questão como a poluição marinha, que pode ser definida a partir da introdução de forma direta ou indireta, pelo homem, de substâncias ou energia no ecossistema. Que logo, vão resultar em efeito deletério aos seres vivos, causando prejuízo à saúde humana e redução da qualidade da água e de atividades como pesca, recreação e outras (BÍCEGO et al, 2008). Dentre os impactos decorrentes dessas atividades, vale enfatizar a contaminação de águas superficiais pelo vazamento direto dos minerais extraídos ou seus componentes, tais como o petróleo (PENA, 2016). Em 2019, a ação antrópica também causou um grande desastre ambiental com o derramamento de óleo proveniente de petróleo em praias do Nordeste (DANTAS et al., 2019). Esse desastre está levando um prejuízo sem precedentes aos ecossistemas aquáticos, uma vez que, além de poluir o ecossistema marinho acaba também acometendo os organismos aquáticos que o compõem. Haja visto, que o óleo pode impedir de fazer as trocas necessárias com o meio, como a respiração, alimentação, processo fotossintético, eliminação de excreta, além de alterar também a temperatura do corpo (CETESB, 2020). Diante desses derramamentos de petróleo, os poluentes comumente encontrados nos ambientes aquáticos são hidrocarbonetos (KENNISH, 1991). O petróleo abrange uma série de 15 hidrocarbonetos, incluindo também os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), os quais são considerados poluentes orgânicos de grande importância ambiental apresentando efeito toxicológico, pois muitos apresentam propriedades pré-carcinogênicas e/ou mutagênicas para homens e animais (CAMARGO; TOLEDO, 2002). Dentre os HPAS constituintes do petróleo podemos destacar então o antraceno, o qual é pouco volátil e costuma se depositar no fundo dos ambientes aquáticos, como por exemplo, nos sedimentos dos manguezais, sendo, portanto, de difícil separação (JEONG; CHO, 2005). O antraceno é um dos poucos HPAs produzidos industrialmente, sendo também obtido a partir do carvão (VERSCHUEREN, 2001). Dessa forma, medidas de combate ao petróleo e seus constituintes, incluindo o antraceno, são necessárias para a biorremediação dos manguezais afetados. Neste contexto, o uso de enzimas tem sido empregado para a degradação de HPAs (NEMADZIVA et al., 2018; MUÑIZ-MOURO et al., 2018; REANO et al., 2016; NAGHDI et al., 2019; DARONCH et al., 2020). Além disso, a carcinicultura marinha apresentou significativo desenvolvimento, a partir da introdução de Litopenaeus vannamei (BOONE, 1931). Desse modo, a partir do reaproveitamento dos subprodutos dos camarões é possível obter lacases, as quais são enzimas do tipo cobre oxidases que catalisam a oxidação de vários compostos aromáticos, fazendo a redução do oxigênio molecular à água (RIVA, 2006). Essas enzimas são muito caracterizadas em fungos e bactérias (CAVALLAZZI; OLIVEIRA; KASUYA, 2004) e, nos últimos anos, sua atividade tem sido também descoberta em organismos aquáticos (THEERACHAT et al., 2018). Estas enzimas catalisam a oxidação de uma variedade de compostos fenólicos e aromáticos, como a lignina, aminas, ésteres, éteres e alguns íons inorgânicos com a concomitante redução do oxigênio à água (SHLEEV et al., 2009). As lacases têm contribuído na degradação dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (FILAZZOLA et al., 1999). Desta forma, o uso de lacases do camarão Litopenaeus vannamei, que é uma espécie originaria do Oceano Pacífico (BRASIL, 2001), irá contribuir com a redução do impacto ao meio ambiente pelo reaproveitamento dos subprodutos da indústria pesqueira e também na degradação do antraceno, uma vez que, a mesma apresenta potenciais biotecnológicos, bem como pode atuar na biodegradação dos HPAs em ambientes contaminados (PACHECO; SOARES, 2014). 16 2. REVISÃO DE LITERATURA PETRÓLEO: POTENCIAL POLUIDOR Segundo Amaral et al. (1972), um dos minerais marinhos mais bem explorado no Brasil é o petróleo. Visto que, é dos recursos não-renováveis mais usados no dia a dia da atual sociedade moderna (BOZELLI et al., 2008). Este, por sua vez, é uma substância bastante utilizada nos mais diversos setores de produção, servindo como combustível na produção de energia elétrica, na indústria e no transporte (CLIFON, 2014). Além disso, as atividades de mineração dos hidrocarbonetos de petróleo também vêm ocorrendo em grande escala, as quais são potenciais causadoras de impacto ambiental, tanto em suas etapas de exploração quanto de produção (ELLIS, 1988). Uma vez que, a intensa exploração do petróleo acaba acarretando em derrames de óleo (de pequenas ou de grandes proporções) no ambiente marinho por conta do transporte e distribuição do produto ao longo da costa (RIOS, 2014). No entanto, apesar de sua grande relevância e aplicação, os ecossistemas localizados adjacentes às áreas de extração, processamento, distribuição e rotas de transporte do óleo, estão altamente susceptíveis aos impactos diretos e indiretos provocados por essas atividades (CLIFON, 2014). Estima-se que, na atualidade, sejam produzidos cerca de 80 milhões de barris deste óleo por dia (EIA, 2018), onde a maioria é conduzida por rotas marítimas. No Brasil, o processo de extração se intensificou a partir do século XXI, com a descoberta do pré-sal (RODRIGUES; SUSLICK, 2009; LIMA; LIMA, 2017). Um dos maiores exemplos de acidente desse tipo registrado é a da plataforma de petróleo Deepwater Horizon (BP), ocorrido no Golfo do México, em 2010. Estima-se que, através desse desastre, houve o derramamento de cerca de 700.000 m³ de óleo ao longo de três meses (PEREZ-UMPHREY et al., 2018), gerando morte de vários organismos. O petróleo é uma mistura complexa que contém uma abundância de substâncias tóxicas conhecidas, incluindo compostos orgânicos voláteis (VOCs), hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), e metais pesados. Os danos à saúde e a gravidade dos efeitos da exposição ocorre por ingestão, absorção por meio da pele íntegra e inalação, dependendo da dose e do tempo de exposição a essas toxinas. Os riscos toxicológicos envolvidos são caracterizados por graves, agudos e crônicos, pois, frações de petróleo podem levar à morte por intoxicação, especialmente, quando associado aos compostos aromáticos (SAVITZ; ANDREWS , 1997; BAAN et al., 2008). 17 HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS (HPAs) Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) são substâncias químicas formadas naturalmente ou antropogenicamente durante a combustão incompleta de substâncias orgânicas como o carvão mineral, óleo cru, dentre outras substâncias (USDHS,1995). São compostos constituídos unicamente de átomos de carbono e de hidrogênio, arranjados na forma de dois ou mais anéis aromáticos (LI, J; Li, F; LIU, 2017). Devido à possibilidade de fusão de um número variável de anéis e de várias posições em que estes anéis podem se ligar entre si há atualmente mais de 100 HPAS reconhecidos pela União Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC) (POTIN et al., 2004). Os HPAs são caracterizados pela presença de duplas ligações conjugadas em suas estruturas, as quais são responsáveis por determinar as propriedades físicas e químicas dos mesmos. Além disso, a maioria dos HPAs apresentam-se em sua forma sólida em condições de temperatura ambiente e possuem altas temperaturas tanto de fusão como de ebulição, baixa solubilidade em água e baixa pressão de vapor, onde a solubilidade e a pressão de vapor diminui conforme o aumento da massa molecular, ou seja, são inversamente proporcionais (NETTO et al., 2000; MEIRE; AZEREDO; TORRES, 2007; VEIGA, 2003; CARUSO; ALABURDA, 2008). A presença dos HPAs no ambiente torna-se preocupante devido à possibilidade destes compostos reagirem com o DNA, tornando-se mutagênicos e carcinogênicos ao homem e aos animais (CAMARGO; TOLEDO, 2002). Ou seja, os HPAS e seus derivados estão associados ao aumento da incidência de câncer no pulmão, intestino, fígado, pâncreas e na pele do homem (CHAKRADEO et al., 1993). Isto é, além de causar defeitos genéticos em humanos, é possível acometer também a fauna e a flora por meio da absorção e acúmulo nas cadeias alimentares (NACCI et al., 2002; DODOR; HWANG; EKUNWE, 2004; RENGARAJAN et al., 2015; YUAN et al., 2017). Dessa forma, como a presença de HPAs no meio ambiente é considerada um risco para os organismos a eles expostos, surge à necessidade de avaliar a distribuição desses compostos tóxicos e adotar medidas para a sua degradação (GUO et al., 2011). ANTRACENO O antraceno é um dos poucos HPAs produzidos nturalmente e de forma contínua. Por meio da combustão incompleta da matéria orgânica, bem como o carvão (HARITASH; KAUSHIK, 2009). Porém, a contaminação ambintal está relacionada à geração antropogênica associada às indústrias petroquímicas, a partir da produção de carvão vegetal e devido ao 18 processo de extração, transformação, transporte e utilização do petróleo (BAMFORTH; SINGLETON, 2005). É obtido por meio do carvão numa fração conhecida como “óleo de antraceno” ou “óleo verde”. O antraceno também conhecido como antracin ou paranaftaleno, é formado por três anéis benzênicos, arranjados de forma linear (Figura 1), apresentando uma massa molecular de 178,2 g e uma solubilidade em água de 0,076 mg L-1 (IARC, 1973). O antraceno também é utilizado pela indústria, principalmente na produção de corantes, na produção de fibras sintéticas, além de outros usos (HAWLEY, 1993). Em razão de apresentar menor toxicidade em comparação dos demais HPAs, o antraceno tem sido utilizado como modelo para estudos envolvendo a dinâmica dos HPAs no ambiente. Figura 1. Fórmula estrutural do antraceno. Fonte: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/8418. BIORREMEDIAÇÃO: SOLUÇÃO ECOLOGICAMENTE VIÁVEL A biorremediação consiste no processo de descontaminação do solo e da água, ou seja, é um método que tem como objetivo transformar e degradar contaminantes em substâncias não- tóxicas ou atingir uma menor toxicidade quando comparada ao seu estado original (HORNUNG, 1997). Esta técnica utiliza de organismos vivos como plantas, microrganismos ou suas enzimas, para fazer a remoção ou reduzir os poluentes no ambiente (GAYLARD; BELLINASO; MANFIO, 2005). A biorremediação é uma estratégia bastante significativa a ser empregada para degradar os HPAs, visto que, a biorremediação é um processo natural, portanto, é considerado um processo seguro (MASHI, 2013). Além disso, é um processo que apresenta custo de tratamento mais baixo, quando comparado às outras técnicas de tratamento de áreas degradadas (ANDRADE; AUGUSTO; JARDIM, 2010). Por outro lado, uma das desvantagens da 19 biorremediação é que muitas das técnicas utilizadas são consideradas lentas (VIDALI, 2001). Dentro do contexto apresentado, tem sido utilizado o reaproveitamento de subprodutos da carcinicultura do camarão marinho Litopenaeus vannamei, a principal espécie de camarão cultivada no Brasil (PONTES; ARRUDA, 2005). Neste contexto, os rejeitos do cultivo de camarão representam cerca de 50% da biomassa desse animal, a qual também é descartada de forma inadequada no meio ambiente. Por meio desses rejeitos, tem sido possível obter enzimas, as quais podem ter atividades de detoxificação de compostos tóxicos ao meio ambiente (CAHÚ et al., 2012). Assim, torna-se possível promover a biorremediação por meio do reaproveitamento dos sub-produtos da indústria pesqueira e do uso do mesmo para a produção de enzimas de degradação de compostos danosos, como as lacases. LACASES As lacases, também conhecidas como enzimas multicobre e são classificadas como oxirredutases. As mesmas são produzidas na natureza por bactérias, alguns insetos e em maior quantidade por fungos, especialmente dos filos Ascomycota e Basidiomycota, predominando neste último grupo, que são conhecidos de fungos da podridão branca (MISHRA et al., 2010; BALDRIAN, 2006). Além do mais, as lacases são predominantemente enzimas extracelulares, o que facilita a sua ação e atividade (SHLEEV et al., 2009). As lacases apresentam uma característica muito importante que é a baixa especificidade por substratos. Isto é, são capazes de apresentar atividade em diferentes substratos. Elas catalisam a oxidação de uma variedade de compostos fenólicos e aromáticos com a concomitante redução do oxigênio molecular à água. (BALDRIAN, 2006; MAJEAU et al., 2010). A lacase realiza a oxidação via abstração de um elétron de fenóis para radicais fenoxila, sendo que é a sequência de aminoácidos constituintes da enzima que vai determinar a sua especificidade pelo substrato prestes a ser oxidado. Isto é, lacases de diferentes fungos podem então oxidar diferentes substratos, inclusive em diferentes faixas de pH (RINGLING e VAN ALFEN, 1993). Sabe-se ainda, mais recentemente, do uso destas enzimas em diferentes aplicações ambientais (MIGLIORE et al., 2012; LI et al., 2012; SINGH; AHLAWAT; RAJOR, 2012; BALAN; SATHISHKUMAR; PALVANNAN, 2012; ASGHER; ASLAM; IQBAL, 2013; CHANG; CHANG, 2014; HADIBARATA; KRISTANTI, 2014). Uma vez que, as lacases tanto em sua forma livre como também imobilizadas têm sido empregadas na degradação de poluentes (NEMADZIVA et al., 2018; MUÑIZ-MOURO et al. 2018; REANO et al., 2016; NAGHDI et al., 2019; DARONCH et al., 2020). Vale salientar que, além da importância 20 ecológica e ambiental, uma vez que participam do ciclo do carbono, promovendo a degradação de compostos de plantas, as lacases possuem um vasto campo de aplicação biotecnológica como eficiência no processo de degradação de fármacos e de corantes (TOUAHAR et al., 2014; LLORET et al., 2012). As lacases também são muito utilizadas em aplicações industriais, como a detoxificação de efluentes e resíduos das indústrias petroquímica e têxtil, na produção alimentícia e de papel, biorremediação, remoção, precipitação ou transformação de compostos tóxicos e recalcitrantes, biodegradação de componentes xenobióticos, biosensores, dentre outras atividades (Figura 2) (RANGELOV; NICELL, 2015; ARORA; SHARMA, 2010). FIGURA 2: Principais áreas de aplicação de lacases Fonte: KATO-SCHWARTZ et al., 2020. A lacase é composta por um sítio ativo formado por quatro átomos de cobre (Figura 3), os quais são divididos em três grupos, caracterizados em função de suas características espectroscópicas, que vão desempenhar seus diferentes papéis durante o processo enzimático (DURÁN et al., 2002; PIONTEK; ANTORINI; CHOINOWSKI, 2002). Além disso, a atividade catalítica da lacase está intimamente relacionada à presença desses 4 átomos de cobre (CLAUS, 2004; LEONTIEVSKY et al. 1997a). Por convenção, um cobre é designado do tipo 1 (T1), dois cobres são do tipo 3 (T3) e um quarto é do tipo 2 (T2). Na região do cobre T1 é onde ocorre a oxidação do substrato, os elétrons recebidos por este cobre e então são transferidos para o “cluster” trinuclear formado por dois átomos de cobre T3 e um cobre de T2, onde ocorre a redução do oxigênio molecular (DURÁN et al., 2002; PIONTEK; ANTORINI; CHOINOWSKI, 2002). 21 Figura 3: Representação esquemática dos centros de cobre da enzima lacase (DURÁN et al., 2002; PIONTEK; ANTORINI; CHOINOWSKI, 2002). O ciclo catalítico da lacase engloba três principais passos: a) redução do cobre tipo 1 com a simultânea oxidação do substrato. Além disso, um outro fator importante a ser ressaltado com relação a este cobre é a ligação covalente que o mesmo apresenta com a cisteína, isto é, a este átomo de cobre encontra-se duas histidinas e uma cisteína como ligantes conservados, e apresentam também a presença de um ligante variável. Em bactérias esse ligante é a metionina, já em lacases fúngicas há uma leucina e uma fenilalanina como ligante (CLAUS, 2004). Essa diferença de ligante variável pode ser um fator preponderante na relação da proteína com o substrato, uma vez que pode interferir na interação da proteína com os contaminantes em questão (SAKURAI; KATAOKA, 2007). Essas diferenças estruturais entre as enzimas podem levar a diferentes especificidades para os sítios de ligação, desta forma, interferindo na ação da lacase na degradação de um determinado substrato (KUMAR et al, 2003), como o antraceno; b) transferência de elétrons do cobre tipo para os cobres tipo 2 e 3. O cobre tipo 2 fica próximo ao cobre tipo 3 e o mesmo é composto por duas histidinas; c) redução do oxigênio molecular para água através de sua interação com os cobres tipo 2 e 3, e no cobre tipo 3 estão seis moléculas de histidina (GIANFREDA et al., 1999; DURÁN et al., 2002). 22 IMPORTÂNCIA DA BIOINFORMÁTICA NO ALINHAMENTO DE SEQUÊNCIAS A bioinformática é um campo interdisciplinar, onde a mesma emergiu diante da necessidade de fusão da biologia/ciência com a informática, visto que, por meio da tecnologia a qual engloba um desenvolvimento sistêmico e aplicação de soluções de tecnologia da informação para lidar com informações biológicas, bem como, acesso a coleção e armazenamento de dados biológicos, permissão de pesquisas em bancos de dados, análises e interpretação e modelagem (DEGRAVE et al., 2002; XIONG, 2009; JAYARAM; DHINGRA, 2010). Ou seja, a bioinformática é uma ferramenta criada que auxilia na análise de dados biológicos (KUMOR, 2009). Então, com o rápido desenvolvimento de tecnologias genômicas especialmente as técnicas de sequenciamento automático, foi produzido uma enorme quantidade de dados baseado em sequências de nucleotídeos e proteínas. Hoje em dia, é possível ver vários bancos de dados que auxiliam e facilita os estudos envolvendo proteínas como o GenBank (BENSON, 2004), Uniprot (APWEILER et al., 2004), PDB (BERMAN, 2000), PubMed Medline, etc., os quais além de exibir as sequências de nucleotídeos e proteínas, também disponibiliza anotações e publicações de pesquisas relacionadas. A bioinformática tem muitas aplicações práticas em diferentes áreas da biologia e da medicina. Na bioinformática, as atividades comuns incluem mapear e analisar as sequências de DNA, RNA e proteínas, alinhar diferentes sequências de DNA e proteínas para poder compará- las e visualizar modelos 3D das estruturas das proteínas (LUSCOMBE et al., 2001; NILGES; LINGE, 2009). Há três aspectos da análise bioinformática de grande importância, as áreas de análise de sequências: consistem no alinhamento de sequências, pesquisa de banco de dados de sequêcias, reconstrução de relações evolutivas e montagem e comparação de genomas. As análises estruturais englobam análise, classificação, comparação e previsão da estrutura de ácidos nucléicos e proteínas. Já, a análise funcional abrange perfil de expressão gênica, previsão de localização subcelular de proteína, reconstrução e simulação de vias metabólicas e previsão de interação proteína-proteína (RAO et al., 2008; XIONG, 2009). Dessa forma, a bioinformática tem sido uma ferramenta de grande importância no alinhamento de sequências, visto que, é possível identificar os genes nas sequências de DNA de vários organismos, alinhar sequências semelhantes e gerar árvores filogenéticas para 23 examinar as relações evolutivas (TRAMONTANO, 2009), fazer a interpretação de domínios e de proteínas e suas estruturas (WALES, 2009), prever sítios ativos nas estruturas de proteínas, encontrar todos os genes e proteínas de um genoma a partir de uma determinada sequência de aminoácidos (RAO et al., 2008). 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral Utilizar ferramentas de bioinformática, visando entender a estrutura da enzima lacase do camarão Litopenaeus vannamei em comparação com lacases de outros organismos e determinar a degradação de antraceno. 3.2 Objetivos Específicos 1 - Analisar uma sequência de aminoácidos predita de lacase de L. vannamei; 2 - Identificar os resíduos conservados na sequência da lacase de L. vannamei; 3 - Determinar o grau de homologia da lacase de L. vannamei com lacases dos outros organismos; 4 - Mensurar a degradação de antraceno pela lacase de L. vannamei. 4. METODOLOGIA Obtenção e análise da sequência da lacase de Litopenaeus vannamei Inicialmente foi realizada a busca da sequência do RNAm de uma enzima lacase do camarão Litopenaeus vannamei por meio do banco de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) o qual é uma secção da biblioteca nacional de medicina dos Estados Unidos. Em seguida, essa mesma sequência encaminhou-se para o Expasy (https://web.expasy.org/translate/), que é um portal de recursos bioinformático, que usa como parâmetro a sequência de DNA e o formato de saída é apenas a sequência FASTA, por meio deste foi realizado o processo de tradução para a determinação da sequência de aminoácidos putativa. Além disso, por intermédio da ferramenta ORFfinder Home (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) que utiliza como parâmetro a sequência fasta, foram adquiridos os quadros abertos de leitura (Open Reading Frames – ORFs). Posteriormente, com o auxílio da literatura foi analisada se havia a presença de resíduos conservados ou de domínios http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) 24 cobre-oxidases na enzima lacase, visto que, são estritamente necessários para a estrutura da proteína ou para sua função. Análise da homologia com lacases de outros organismos Para a compreensão dos resíduos conservados da lacase de L. vannamei, a mesma foi alinhada com sequências de lacases de outros artrópodes por meio de dois programas: o primeiro é o Blastp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&BL AST_SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=blastx), o qual utiliza como algoritmo blastp (proteína-proteína BLAST) para mostrar outras proteínas similares a proteína usada como base para comparação, esse programa ainda destaca o percentual de identidade da sequência de interesse traduzida com sequências de outros organismos. Além disso, deu-se início ao uso do programa Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), utilizando como parâmetro o ClustalW com contagem de caracteres, por meio deste ocorreu então o alinhamento das sequências destacando os resíduos de aminoácidos conservados e semiconservados. Purificação parcial da lacase A purificação parcial das lacases ocorreu a partir da realização do extrato bruto do hepatopâncreas do Litopenaeus vannamei, onde posteriormente foi removido o hepatopâncreas e feito o extrato enzimático na concentação de 4mg/mL, contendo tampão tris-HCl 0,1M pH 7,5. Logo após ocorreu a centrifugação à 8000XP por 15 minutos a temperatura de 4°C, após o tempo de centrifugação é retirado o líquido e o restante descartado. Em seguida, foi dado início ao processo de purificação por meio da técnica de cromatografia de afinidade com a Concanavalina-A. Então, primeiro foi adicionado o tampão de equilíbrio que é tris-HCl 0,1M pH 7,5 contendo os sais NaCl 0,5M, CaCl2 0,1mM e MnCl2 0,1mM, o tampão de equilíbrio vai equilibrar a coluna, a seguir passa-se todo o extrato, e posteriormente adicionou-se novamente o tampão de equilíbrio e depois o tampão de eluição, o qual contém 0,5M de sacarose, sendo este coletado de 1 mL em 1 mL. Posteriormente, foi dosado a atividade da lacases das frações coletadas pelo uso da hidroquinona como substrato e as frações que apresentaram maior atividade de lacase foram submetidas a diálise para fazer a remoção da sacarose deixando apenas a lacase. A purificação foi feita de acordo com a metodologia de Nivedita, Veda e Upendra (2015). http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&BL http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0141813014005765?via%3Dihub#! https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0141813014005765?via%3Dihub#! https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0141813014005765?via%3Dihub#! 25 Teste colorimétrico de degradação do antraceno A avaliação da capacidade de degradar o antraceno pela a enzima lacase foi realizada seguindo a metodologia de Alcalde, Bulter e Arnold (2002) considerando alterações em algumas proporções. Para a incubação, foi utilizado 5 mL de uma solução de Tris-HCl 0,1M pH 8,0 contendo 1% de Tween 20 e 2% de etanol grau P.A., 100µM de solução de antraceno e 2 mL da lacase purificada. A mistura foi submetida a reação por 48h, armazenada a temperatura ambiente e sem incidência luminosa. Após o tempo de incubação, 600 µL de uma solução de borohidreto de sódio 1M em NaOH 40% foi misturada a 600µL de etanol grau P. A. Em seguida, 200 µL desta solução foi adicionada a 200 µL da incubação do teste de degradação. A leitura foi realizada após 15 minutos da reação incubada nas mesmas condições anteriores e submetidas ao espectrofotômetro para a leitura a partir da absorbância em um comprimento de onda de 419 nm para identificação da formação do 9,10-antraquinona. 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os estudos propostos contribuirão para o desenvolvimento do trabalho sobre a enzima lacase, desde a sua estrutura até a sua aplicação e importância, principalmente do ponto de vista ecológico. Uma vez que, o intuito do trabalho é utilizar enzimas lacases para serem empregadas no processo de biorremediação de ambientes contaminados pelos contituntes do petróleo, como o antraceno. Desse modo, a partir de ferramentas da bioinformática foi possível obter a sequência fasta da enzima lacase do camarão Litopenaeus vannamei. Ademais, vale salientar que, durante a análise feita com base na estrutura/constituição da enzima lacase por meio desta sequência, foi concluído que a mesma apresenta resíduos conservados ou os domínios cobre-oxidases (Figura 4). Esses domínios cobre-oxidases são muito relevantes, pois eles são responsáveis pela oxidação de diversos compostos aromáticos através da redução do oxigênio molecular à água (BALDRIAN, 2006; MAJEAU et al., 2010). Ou seja, esses resíduos conservados são muito significativos, pois, os mesmos apresentam importância funcional e estrutural para o funcionamento adequado da enzima (SUTTO et al, 2015). Isto é, alguns dos resíduos são conservados por questões funcionais, enquanto que outros são por questões estruturais. Visto que, se esses resíduos conservados forem responsáveis de compor o sítio catalítico, caso haja mutações nesses resíduos causará inatividade da proteína (KINCH; GRISHIN, 2002). 26 Figura 4: Sequência FASTA de aminoácidos da lacase de Litopenaeus vannamei obtida no pubmed. Na sequência, os quatros domínios cobre-oxidases estão destacados em amarelo e um outro domínio conservado (C-X-R-X-C), encontrado perto do N-terminal da proteína está destacado em azul (em que X representa qualquer aminoácido). Como já mencionado anteriormente, por meio do algoritmo Blastp foi então dado início ao processo de alinhamento de sequências das enzimas lacases de diferentes organismos utilizando como base para a comparação a lacase do camarão Litopenaeus vannamei. Nesse caso, o alinhamento de sequências é uma ferramenta de grande importância para a construção de árvores filogenéticas, na identificação de resíduos conservados e nas funções de proteínas e de suas estruturas secundárias e terciárias (KEMENA; NOTREDAME, 2009). Desse forma, a partir da análise realizada foram selecionados 6 modelos de lacases que apresentaram maiores valores de identidade com relação a lacase do L. vannamei, isso fica evidente na tabela que foi feita com esses respectivos dados, onde fica evidenciado os organismos nos quais essas lacases foram encontradas, bem como também destaca a porcentagem de identidade entre as sequências (Tabela 1). Além disso, por meio do alinhamento de sequencias realizado foi possível observar que dentre as lacases obtidas dos mais variados artrópodes, a lacase de L. monodon que é conhecido como camarão-tigre gigante, apresentou um maior percentual de identidade quando comparada com a lacase de L. vannamei. Desse modo, a lacase de L. monodon mostrou-se apresentar um maior grau de similaridade com a enzima lacase de L. vannamei, podendo então ser analisada futuramente para ser empregada na questão da biorremediação dos ambientes contaminados assim como a lacase de L. vannamei. LacaseATU82298.1[Penaeusvannamei] MAVACQCSAVCAATMVALVLAAAIATLTSVITAQEPPTAGSNCYRKCVPGDRRLCHFTFEVHPYQTMSRACHNCPRNASDCS LPDCVPGDGVQRRIIAINKQMPGPPIQVCEGDTIVVDVKNLLPDGGLTVHWHGLTMLGGIRDGIQYPSTPHMDGTPGITQCPI HFGGSFRYTFYALNPGTHWYHAHTGFHRADGVLGAIVIRQPPGKDHATGLYDYDLPQHTMVIHDWLHMPTEDKFVLRHHGG GDDFPESMLINGLGPHQNIAATPTSAAMPYKRFKVSPGARYRFRIINTGILNCPITVHIDEHQLTVIATDGNPVVPTNASSVVVY SGERWDVIVKTENTKVGTFWISFMGGVDCAPSSAHQFALFEYEQVGQFYKTPAYVKQQDGQQEIPDSVLLRHMPPKPVYTEA PPAGVQVNSINSACYDDLICVAGLRSPVPMPEVLRTPRANFTFYLAFEMRQIHNAHFYSRAFYNFESADEDQQIPTPQVNNLSF VGPSTPLLLSGGRYDTRVCSLENPIPGRSCHDDYCECLHMYHVPLGATVEMVFIDEGQHGDENHPIHLHGHHFWVVGMDRPN DVVGAAITRDEVINLDRSGQLMRNFYHPVRKDTVTIPDGGYTVVRFIADNPGYWLMHCHLIFHSAAGMEVVFKVGEVTDIPPS PPGFPSCGNFKYHGL 27 Tabela 1:Percentual de identidade das enzimas lacases obtidas com a enzima lacase de Litopenaeus vannamei (enzima molde). Por meio do alinhamento também foi possível obter o grau de homologia entre os resíduos de aminoácidos da sequência primária da proteína molde (lacase de Litopenaeus vannamei) comas sequências primárias das enzimas obtidas (os seis modelos obtidos a partir do Blastx), demonstrando as regiões conservadas (resíduos de aminoácidos iguais), regiões semiconservadas (resíduos diferentes mais com grande números de propriedades químicas semelhantes) e regiões diferentes (mas com algumas propriedades e funções químicas semelhantes), e região com resíduos diferentes que não apresentam nenhuma propriedade química (Figura 5). Ou seja, o alinhamento entre as sequência diz respeito a análise das semelhanças biológicas observadas entre os organsimos de espécies diferentes, mas que apresentam um mesmo ancestral comum (Darwin, 1859). Isto é, a homologia é uma forte evidência evolutiva pois permite estabelecer ancestralidade comum entre organismos diferentes. Ademais, geralmente as lacases caracterizam-se pela presença de uma metionina no centro de cobre T1, porém a maioria das lacases de plantas e fungos têm uma fenilalanina ou leucina nesta posição, oque de fato pode ter interferido no grau de similaridade das sequências das lacases como também na interação da proteína com os contaminantes em questão (SAKURAI; KATAOKA, 2007). Descrição Nome científico Por. Identidade% Lacase Litopenaeus vannamei 99,69% Lacase Litopenaeus monodon 94,22% Lacase Procambarus clarkii 60,22% Lacase Chiromantes hematocheir 42,41% Lacase Orussus abietinus 41,78% Lacase Asbolus verrucosus 41,37% Lacase Plutella xilostela 40,96% 28 Figura 5: Alinhamento da sequência da lacase de Litopenaeus vannamei com as sequências primárias dos modelos obtidos. Em verde escuro, resíduos conservados, em verde claro, semiconservados e em amarelo claro resíduos diferentes com algumas propriedades e funções químicas semelhantes, em branco resíduos diferentes que não apresentam nenhuma propriedade química semelhante. Os traços nas sequências (--) apontam os “gaps”. 29 Além disso, por meio do Pubchem, foi efetuada a coleta de dados/informações (bem como, a fórmula molecular, peso molecular, ponto de fusão e de ebulição, logP, solubilidade, toxicidade, dentre outros), em relação ao antraceno, que é o hidrocarboneto utilizado na pesquisa com o intuito de identificar a atividade da lacase no processo de degradação do mesmo. De acordo com essas informações, fez-se necessária a construção de uma tabela (tabela 2). Uma vez que, o antraceno é um dos hidrocarbonetos encontrados nos ambientes aquáticos que vem causando prejuízos sem precedentes, desde a poluição até a morte dos que habitam naquele ecossistema (JEONG; CHO, 2005). Tabela 2: Dados do respectivo hidrocarboneto sobre o qual a lacase age obtida pelo Pubchem. Como já mencionado anteriormente, os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAHs) são compostos químicos tóxicos presentes em produtos de origem petroquímica (NACCI et al., 2002; DODOR et al., 2004; RENGARAJAN et al., 2015; YUAN et al., 2017). Dessa forma, surge então a necessidade de degradar o antraceno e propor potenciais estratégias de biorremediação. Então, a degradação do antraceno foi realizada a partir de 2 mL da lacase purificada. Onde a amostra foi encaminhada para leitura após 15 minutos da reação incubada, sendo submetida a leitura da absorbância apresentando 419 nm para a fomação do 9,10-antraquinona que é o produto formado a partir da oxidação do antraceno, visto que, mediante estudos de citotoxicidade do antraceno e antraquinona foram avaliadas, e os resultados ilustraram que a Hidrocarboneto Antraceno Pubchem CID 8418 Número CAS 120-12-7 Fórmula molecular C14H10 Peso molecular 178,23 g/mol Densidade 1,25-1,28 g/cm³ Aparência Incolor Ponto de fusão 217 °C Ponto de ebulição 340 °C Solubilidade em água (25°C) Insolúvel logP 4,45 Ponto de fulgor 121°C Anéis aromáticos 3 anéis Tóxico ( X ) sim ( ) Não 30 antraquinona é menos tóxica que o ANT (HU; WANG; HWANG,2009). No entanto, no experimento de Alcade, Bulter, Arnold (2002), foi utilizado a lacase de dois fungos Trametes versicolor e Myceliophthora thermophilacom potenciais redox muito diferentes e na presençade mediadores. Assim como foi relatado em outros estudos (JOHANNES; MAJCHERCZYC; HUTTERMANN, 1996), que a oxidação do HPAs foi considerada melhorada devido adição de compostos mediadores. Em particular, a lacase de T. versicolor apresentou níveis significativos de oxidação comacenafteno (100%), antraceno (95%), benzo[a]pireno(94%), acenaftileno (90%), perileno (90%), fluoreno (85%),e benzo[b]antraceno (60%). Por outro lado, M. thermophila lacase obteve um alto rendimento de oxidação apenas comantraceno (70%). Comparando ao trabalho de Alcade, Bulter e Arnold (2002), onde eles ressaltam que a lacase sozinha também é capaz de oxidar xenobióticos, mas a atividade de lacase não mediada é muito baixa para aplicações práticas. Neste trabalho a lacase de L. vannamei apresentou uma taxa de degradação significativa, visto que, a oxidação do antraceno foi realizada na ausência de mediadores diferentemente do trabalho dele, conseguido degradar 95% do mesmo hidrocarboneto (figura 6). Figura 6: Acompanhamento da degradação do antraceno pela enzima lacase do camarão Litopenaeus vannamei na ausência de mediadores.O resultado encontra-se expresso pela média ± desvio padrão (n=3) do experimento realizado em triplicata, seguido pela análise estatística pela ANOVA e fator de Tukey (p <0,05), sendo indicado as diferenças estatísticas pela correspodência de letras diferentes (a,b,c). A) Assim que realizado o experimento no tempo de 0 horas já ouve a degradação do antraceno de 10%. B) após o tempo de incubação de 2h ouve um aumento na taxa de oxidação chegando a 50%. C) em 48h de incubação foi possível vizualizar a maior atividade da enzima, conseguindo degradar 95% do antraceno. 31 6. CONCLUSÕES Com relação a importância da aplicação da bioinformática no presente trabalho, pode- se concluir que a mesma é uma ferramenta chave para o desenvolvimento da pesquisa, uma vez que, todos os dados necessários bem como a obtenção da sequência fasta da enzima, o alinhamento de sequências, o percentual de identidade e os resíduos conservados foram obtidos por meio do auxílio de programas bioinformáticos e seus algoritmos, dessa forma, a bioinformática se mostra útil para o desenvolvimento de trabalhos relacionados a tecnologia genômica e proteômica. Dessa forma, pode-se concluir que a enzima lacase do camarão mostrou-se benéfica para ser empregada no processo de biorremediação de ambientes marinhos contaminados pelos HPAs, visto que, a mesma obteve um resultado significativo na degradação do antraceno, conseguindo degradar 95% do antraceno na ausência de mediadores. Ou seja, podemos concluir que o este trabalho apresentou resultados promissores no processo de biodegradação do antraceno a partir do uso da lacase do camarão Litopenaeus vannamei, visto que, o objetivo de vários trabalhos é desenvolver uma lacase que funcione eficientemente na ausência de mediadores, uma vez que os mesmos são tóxicos, pouco solúvel e caro. 32 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALCALDE, Miguel; BULTER, Thomas; ARNOLD, Frances H. Colorimetric Assays for Biodegradation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons by Fungal Laccases. Journal of Biomolecular Screening, v. 7, n. 6, p. 547–553, 1 dez. 2002. AMARAL, C.A.B.; VICALVI, M.A.; BARRETO, L.A. & SANTANA, C.I., 1972. Recursos minerais da margem continental brasileira. Anais do XXVI Congresso Brasileiro de Geologia, 2: 289-299. ANDRADE, J. A.; AUGUSTO, F.; JARDIM, I. C. S. F. Biorremediação de solos contaminados por petróleo e seus derivados. Eclética Química, São Paulo, v. 35, n. 3, p. 17-43, set. 2010. APWEILER, R. (2004). 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OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral 3.2 Objetivos Específicos 4. METODOLOGIA Análise da homologia com lacases de outros organismos 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 6. CONCLUSÕES 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS